华南区***总部(图)-安普利PCR仪迎2020优惠保-安普利

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1.戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；

2.使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；

3.避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，安普利PCR仪2020报修电话，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；

4.操作多份样品时，制备反应混合液，安普利PCR仪迎2020优惠保，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精r确度；

5.***后加入反应模板，加入后盖紧反应管；

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二．实时荧光PCR技术靶***的确定及引物和探针的设计原则

1．靶***的确定：选择检测组共有的***以避免r检测的假阴性(漏检)。

2．检测片段的确定：选择检测组内的保守 (突变少)（避免假阴性）、组间特异的序列 (突变多)（避免假阳性）作为引物探针的设计位置。片段长度70-150bp。

3．引物：长度17-25bp;GC含量30-80%;退火温度(Tm值)58-60℃；避免稳定的引物二聚体（特别是多联检测）及发夹结构(自由能大于-3.5kc/m)；序列不能出现连续的G，安普利PCR仪降温很慢维修案例，3’端避免G或C，***后5个碱基内避免两个以上的G或C。

4．探针：长度20-30bp（Taqman)或16-25bp(MGB)；GC含量30-80%；Tm值为68-70℃；避免稳定的二聚体及发夹结构 (自由能大于-3.5kc/m)；5’端不能是G；位置尽量靠近上游引物；选择波长差异较大（多联检测）或Fam(单联检测）的荧光标记。

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非特异的测序结果体现在峰图上就是2个或多个峰重叠，代表测到了不同产物的碱基。重叠峰可能是相同高度也可能其中一个占据主优势。使用非特异测序结果需谨慎，因为软件往往无法准确区分重叠峰。

常见原因及解决策略

1、PCR片段存在插入、缺失或点突变。

2、PCR残余引物未去除干净。

3、测序反应中有多重PCR产物：有时，琼脂糖电泳时看是一条带，其实是很多相似或相同大小的扩增子。可以通过巢式引物或***后测序解决这个问题。

4、测序反应中同时加入了两条引物，注意所有测序反应都只需要一条引物。

当测序信号过强以致在其他通道内都能检测到此信号称为光谱拉高，这种现象通常表现为T峰下面有C、A峰。这是因为测序时荧光染料有重叠的发射光谱，分析软件会使用相同的算法计算每种染料峰，当某种染料峰强度过高时会***这个校准，从而导致其他颜色的染料峰。

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